Germany
July 17,2024
HIRI researchers present the PUMA technology for the precise detection of RNA with DNA-cutting Cas12 nucleases
CRISPR-Cas systems, defense systems in bacteria, have become a plentiful source of technologies for molecular diagnostics. Researchers at the Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) in Würzburg have expanded this extensive toolbox. Their novel method, called PUMA, enables the detection of RNA with Cas12 nucleases, which naturally target DNA. PUMA promises a wide range of applications and high accuracy. The team published its results in the journal Nature Communications.
Bacteria have developed special defense mechanisms to protect themselves against viruses, which by no means infect only humans. As part of these so-called CRISPR-Cas systems, a CRISPR ribonucleic acid (crRNA), which serves as a “guide RNA,” recognizes regions of a foreign genome, such as viral DNA. The CRISPR-associated (Cas) nuclease, directed by a crRNA, then renders it harmless by cutting it like a pair of scissors. Humans have exploited this strategy: “CRISPR, often referred to as ‘gene scissors’, is the basis of many molecular technologies,” says Chase Beisel, head of the RNA Synthetic Biology department at the Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) in Würzburg. The institute is a site of the Braunschweig Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) in cooperation with the Julius-Maximilians-Universität (JMU) of Würzburg, where Beisel holds a professorship.
The diagnostic platform LEOPARD, developed by Beisel’s lab in cooperation with JMU in 2021, also leverages CRISPR as a technology. LEOPARD has the potential to detect a variety of disease-related biomarkers in just one test. The approach is based on reprogramming RNA factors, so-called tracrRNAs. Those RNAs are naturally involved in helping produce guide RNAs used by Cas9 and different Cas12 nucleases. “LEOPARD focused on Cas9. However, CRISPR-Cas systems also include another diverse set of nucleases, called Cas12,” explains Beisel. While both Cas9 and Cas12 cut DNA targets, Cas12 can increase the output signal by performing cuts on “collateral” DNA. This can make detection technologies more sensitive and, therefore, more efficient.
The team led by Chase Beisel has now extended the unique features of LEOPARD to Cas12. The researchers have named the resulting method PUMA (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases). The details of their findings are the subject of a paper in the journal Nature Communications.
Overcoming hurdles
Although Cas12 nucleases are widely used in molecular diagnostics, two major limitations have persisted: Cas12-based technologies have been restricted to DNA targets, and a specific recognition sequence called a PAM, short for protospacer-adjacent motif, is required to identify the target molecule.
PUMA elegantly addresses these challenges. Like LEOPARD, this new method also relies on tracrRNAs. “Using PUMA, we can reprogram the tracrRNAs. This allows us to decide which RNA biomarker becomes a guide RNA. This guide RNA, in turn, directs Cas12 to a DNA molecule that we provide and activates the gene scissors,” explains the study's first author, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, a former graduate student and postdoctoral researcher in the Beisel lab, was also involved in the development of LEOPARD. He recently started a professorship at the National University of Singapore. “DNA cutting then tells us which biomarker was present in the sample, such as biomarkers specific to different pathogens,” adds Beisel.
The novel method therefore enables the detection of RNA biomarkers using CRISPR nucleases that can normally only recognize DNA. “This is particularly important for molecular biomarkers that can only be found at the RNA level. This includes RNA viruses, for example,” says Beisel. And yet, PUMA does not require a specific recognition sequence: The PAM is contained in the DNA target molecule provided. Since the researchers provide the target molecule, they can also introduce truncated DNA. As a result, they were able to significantly increase the speed of the method.
Several birds, one stone
“PUMA has the potential to become a flexible and precise tool for RNA detection,” concludes Beisel. Finally, the team demonstrated the potential of the method by identifying five bacterial pathogens associated with acute sepsis. Their detection relied on a single universal, reprogrammed tracrRNA, which provides a simplified means of differentiating between various types of bacteria. This opens up a wide range of potential applications in medicine: “The new technology represents a novel form of CRISPR diagnostics that enables reliable molecular testing at the point of care—whether for the identification of viral or bacterial pathogens or the detection of cancer biomarkers,” says Jiao.
The research team is already planning its next steps: “Our goal is to achieve a multiplexed readout similar to that of LEOPARD and to expand the range of applications for the technology,” says Beisel, who also anticipates broad use in the research community: “We hope that our study will spur further exploration of tracrRNA reprogramming.”
The study was supported by funds from the European Research Council (ERC Consolidator Award to Chase Beisel) and the “GO-Bio initial” program of the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF).
Original publication
Jiao C, Peeck NL, Yu J, Ghaem Maghami M, Kono S, Collias D, Martinez Diaz SL, Larose R, Beisel CL (2024) TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-024-50243-x
Neuzugang im CRISPR-Werkzeugkasten: Mit der Genschere RNA nachweisen
HIRI-Forschungsteam präsentiert Technologie PUMA zur präzisen Detektion von RNA mit DNA-schneidenden Cas12-Nukleasen
Die bakteriellen CRISPR-Cas-Abwehrsysteme haben sich zu einer bedeutenden Ressource für molekulare Diagnoseverfahren entwickelt. Forschende des Würzburger Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) haben diesen umfangreichen Werkzeugkasten nun erweitert: Ihre neuartige Technologie, PUMA genannt, ermöglicht den Nachweis von RNA mit Cas12-Nukleasen, die herkömmlicherweise DNA schneiden. Die Methode verspricht dabei vielseitige Anwendungsmöglichkeiten und hohe Genauigkeit. Seine Ergebnisse hat das Team in der Fachzeitschrift Nature Communications veröffentlicht.
Bakterien haben spezielle Abwehrmechanismen entwickelt, um sich gegen Viren zu schützen – denn diese befallen keineswegs nur den Menschen. Bei diesen sogenannten CRISPR-Cas-Systemen erkennt eine CRISPR-Ribonukleinsäure (crRNA), die als „Leit-RNA“ dient, Regionen fremden Erbguts, zum Beispiel DNA eines Virus. Die von der crRNA geleitete Nuklease (Cas) macht diese DNA dann unschädlich, indem sie sie wie eine Schere zerschneidet. Die Forschung hat sich die Strategie zunutze gemacht: „CRISPR, bekannt als ‚Genschere‘, ist die Grundlage zahlreicher molekularer Technologien“, sagt Chase Beisel, Leiter der Abteilung Synthetische RNA-Biologie am Würzburger Helmholtz-Institut für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI). Das Institut ist ein Standort des Braunschweiger Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Kooperation mit der Julius-Maximilians-Universität (JMU) Würzburg, an der Beisel eine Professur innehat.
Auch die Diagnostikplattform LEOPARD – eine Erfindung des Beisel-Labors in Zusammenarbeit mit der JMU aus dem Jahr 2021 – beruht auf der CRISPR-Technologie. LEOPARD ermöglicht den Nachweis einer Vielzahl von krankheitsbezogenen Biomarkern in nur einem Test. Der Ansatz basiert darauf, RNA-Faktoren, so genannte tracrRNAs, umzuprogrammieren. Diese RNAs sind von Natur aus an der Herstellung von Leit-RNAs beteiligt, die manche Cas-Nukleasen verwenden. „LEOPARD konzentrierte sich auf Cas9. CRISPR-Cas-Systeme umfassen jedoch noch eine weitere, vielfältige Gruppe von Nukleasen: Cas12“, erläutert Beisel. Während sowohl Cas9 als auch Cas12 DNA-Zielmoleküle schneiden können, kann Cas12 das ausgehende Signal erhöhen, indem es „kollaterale“ DNA schneidet. Dies macht die Nachweismethoden empfindlicher und damit effizienter.
Das Forschungsteam um Chase Beisel hat nun die einzigartigen Funktionen von LEOPARD auf Cas12 ausgeweitet. Die daraus entstandene Technologie hat das Team PUMA getauft (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases). Die entsprechende Studie haben die Forschenden in der Fachzeitschrift Nature Communications veröffentlicht.
Hürden überwinden
Zwar sind Cas12-Nukleasen in der molekularen Diagnostik bereits weit verbreitet, doch gab es bisher zwei entscheidende Einschränkungen: Zum einen waren Cas12-basierte Technologien auf DNA beschränkt. Zum anderen musste für den Einsatz der Nuklease eine Erkennungssequenz, genannt PAM (vom engl. protospacer-adjacent motif), vorhanden sein, die das Zielmolekül ausweist.
PUMA bietet nun eine elegante Lösung. Wie LEOPARD stützt sich auch diese neue Methode auf tracrRNAs. „Mithilfe von PUMA können wir die tracrRNAs umprogrammieren. So steuern wir, welcher RNA-Biomarker in eine Leit-RNA umgewandelt wird. Diese Leit-RNA wiederum steuert Cas12 zu einem DNA-Molekül, das wir bereitstellen, und aktiviert die Genschere“, erklärt Erstautor Chunlei Jiao die neue Technologie. Chunlei Jiao war Doktorand und später Postdoc im Beisel-Labor und bereits maßgeblich an der Entwicklung von LEOPARD beteiligt. Jüngst hat er eine Professur an der National University of Singapore angetreten. „Anhand der geschnittenen DNA kann dann festgestellt werden, welcher Biomarker in der Probe vorhanden war, zum Beispiel solche, die für verschiedene Krankheitserreger spezifisch sind“, ergänzt Beisel.
Die neuartige Technologie ermöglicht folglich die Erkennung von RNA-Biomarkern mithilfe von CRISPR-Nukleasen, die normalerweise nur DNA nachweisen können. „Dies ist besonders für molekulare Biomarker von Bedeutung, die nur auf RNA-Ebene gefunden werden können. Dazu gehören unter anderem RNA-Viren“, sagt Beisel. Dabei kommt PUMA ganz ohne Erkennungssequenz aus: Denn diese ist im mitgelieferten DNA-Zielmolekül enthalten. Da die Forschenden das Zielmolekül selbst bereitstellen, können sie auch gekürzte DNA einbringen. Dadurch konnten sie die Geschwindigkeit der Methode deutlich erhöhen.
Mehrere Fliegen, eine Klappe
„PUMA hat das Potenzial, ein flexibles und präzises Werkzeug für den Nachweis von RNA zu werden“, folgert Beisel. Das Team stellte die Leistungsfähigkeit der Methode unter Beweis, indem es aufzeigte, dass PUMA fünf verschiedene bakterielle Erreger nachweisen kann, die mit akuter Sepsis in Verbindung gebracht werden. Ihre Bestimmung basierte dabei auf einer einzelnen universellen umprogrammierten tracrRNA, was folglich eine vereinfachte Methode zur Unterscheidung verschiedener Bakterienarten darstellt. Damit eröffnen sich vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin: „Die neue Technologie repräsentiert eine neue Form der CRISPR-Diagnostik, die zuverlässige molekulare Tests am Point-of-Care ermöglichen könnte – sei es zur Bestimmung von viralen oder bakteriellen Krankheitserregern oder von Krebs-Biomarkern“, so Jiao.
Das Forschungsteam hat bereits die nächsten Schritte geplant: „Wir wollen eine multiplexfähige Auswertung, ähnlich wie bei LEOPARD ermöglichen, und den Anwendungsbereich der Technologie erweitern“, sagt Beisel, der zudem auf eine breite Anwendung in der Forschungsgemeinschaft spekuliert: „Wir hoffen, dass unsere Studie weitere Untersuchungen zur Umprogrammierung von tracrRNA anregt.“
Die Studie wurde aus Mitteln des Europäischen Forschungsrats (ERC Consolidator Award an Chase Beisel) und des Förderprogramms „GO-Bio initial“ des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert.
Originalpublikation
Jiao C, Peeck NL, Yu J, Ghaem Maghami M, Kono S, Collias D, Martinez Diaz SL, Larose R, Beisel CL (2024) TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-024-50243-x
Topics
Species
