Document de décision DD2006-59
Détermination de l’innocuité du maïs (Zea mays L) lignée DAS-06275-8 résistant aux insectes et tolérant au glufosinate-ammonium de Dow AgroSciences Canada Inc.

Un gène artificiel cry1F conçu de manière à s’exprimer de façon maximale chez le maïs a été introduit chez l’hybride Hi-II. Ce gène code une protéine insecticide tronquée très semblable à la protéine native de B. thuringiensis var. aizawai. La protéine Cry1F exprimée dans la lignée DAS-06275-8 est identique à la protéine Cry1F exprimée dans la lignée 1507, dont la dissémination en milieu ouvert et l’utilisation comme aliment du bétail sont autorisées au Canada (Document de décision DD2002-41). La protéine exprimée par B. thuringiensis var. aizawai a des propriétés insecticides contre certaines espèces de lépidoptères lorsque, dans l’intestin de l’insecte, elle est scindée en plusieurs fragments, dont un noyau bioactif qui résiste à la trypsine. L’activité insecticide dépendrait de la fixation du fragment actif à des récepteurs spécifiques situés dans l’épithélium de l’intestin moyen des insectes sensibles, provoquant la formation de pores qui perturbent l’équilibre osmotique, entraînant ultimement la lyse des cellules et la mort de l’insecte.

Des échantillons de tissus de maïs de la lignée DAS-06275-8 ont été prélevés à divers stades de croissance dans six champs expérimentaux représentatifs aux États-Unis et au Canada. Les niveaux d’expression ont été mesurés à divers stades de croissance végétale par dosage immunoenzymatique. Les valeurs de l’expression de la protéine Cry1F en nanogrammes de protéine par milligramme de poids sec de tissu végétal (ng/mg p.s.) obtenues sont les suivantes : de 15 à 30,9 pour les différents stades de croissance foliaire; de 6,75 à 8,82 pour les différents stades de croissance des racines; 7,61 dans la tige, 1,04 dans le grain, 4,58 dans le pollen et 13,9 dans le fourrage. Comme on s’y attendait, les concentrations de Cry1F sont moins élevées dans les tissus de maïs sénescents. Par ailleurs, il a déjà été démontré que la protéine Cry1F se dégrade rapidement dans le sol.

La protéine Cry1F exprimée dans la lignée DAS-06275-8 est identique à celle exprimée dans la lignée 1507. Les études à l’appui de la demande présentée pour la lignée 1507 ont montré que, contrairement à de nombreux allergènes, la protéine Cry1F se dégrade rapidement dans un liquide gastrique simulé. La protéine Cry1F n’est plus bioactive après exposition à une température élevée (> 75 ºC). Une recherche d’homologie de séquences d’acides aminés entre la protéine Cry1F et des allergènes connus n’a pas révélé d’homologie appréciable (soit au moins 8 acides aminés identiques contigus).

De plus, il a été démontré que la protéine Cry1F exprimée dans la lignée DAS-06275-8 n’est pas glycosylée, une autre indication selon laquelle les propriétés de la protéine Cry1F diffèrent de celles des allergènes connus.

Des épreuves ont été réalisées pour montrer l’équivalence entre la protéine Cry1F exprimée dans la lignée de maïs DAS-06275-8 et la protéine Cry1F d’origine bactérienne utilisée dans les essais réalisés chez les organismes non visés et dans les épreuves biochimiques. Les protéines Cry1F d’origine végétale et bactérienne se sont révélées biochimiquement équivalentes. La protéine Cry1F de ces deux sources s’est avérée sensible au clivage par la protéase. Il en a résulté une version tronquée d’environ 65 kDa. Il a été démontré que la réactivité immunologique des deux protéines était similaire, et aucune glycosylation n’a été décelée. La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et l’analyse de la séquence N-terminale ont permis d’établir l’équivalence de séquence des deux protéines.

Le gène de tolérance au glufosinate-ammonium (gène bar) introduit dans la lignée de maïs DAS-06275-8 code la phosphinothricine N-acétyltransférase (BAR), une enzyme qui détoxifie la phosphinothricine en la transformant par acétylation en un composé inactif.

À l’origine, le gène bar a été isolé chez une bactérie aérobie du sol, Streptomyces hygroscopicus. L’enzyme BARM est donc présente naturellement dans le sol. De manière générale, les acétyltransférases sont omniprésentes dans la nature.

Le gène bar exprimé dans la lignée de maïs DAS-06275-8 est lié à un promoteur constitutif. Des échantillons de tissus de maïs de la lignée DAS-06275-8 ont été prélevés à divers stades de croissance dans six champs expérimentaux représentatifs aux États-Unis et au Canada. Les niveaux d’expression ont été mesurés à divers stades de croissance végétale par dosage immunoenzymatique. Les valeurs de l’expression de la protéine BARM en nanogrammes de protéine par milligramme de poids sec de tissu végétal (ng/mg p.s.) obtenues sont les suivantes : de 129,2 à 224,2 pour les différents stades de croissance foliaire; de 61,1 à 70,0 pour les différents stades de croissance des racines; 103,3 dans la tige, 5,94 dans le grain, 0,73 dans le pollen et 106,9 dans le fourrage. Comme on s’y attendait, les concentrations de protéine BARM sont moins élevées dans les tissus de maïs sénescents.

Les protéines allergènes résistent normalement à la digestion. Or, ce n’est pas le cas de la protéine BARM. Il a en effet été démontré qu’elle est rapidement digérée dans un liquide gastrique simulé.

La séquence des acides aminés de la protéine BARM ne présente aucune homologie notable avec celle de toxines répertoriées dans la base de données GENBANK ou des allergènes (comparaison basée sur la présence de séquences d’au moins 8 acides aminés identiques contigus) figurant dans les bases de données courantes de séquences protéiques.

Le gène bar a été exprimé dans un système d’expression bactérien, et l’enzyme résultante a été utilisée pour réaliser des études toxicologiques et on l’a aussi utilisée dans la détermination de l’expression de la protéine chez la plante modifiée. La protéine BAR exprimée dans la lignée de maïs DAS-06275-8 a été comparée à la protéine bactérienne. Les protéines BARM d’origine végétale et bactérienne se sont révélées biochimiquement équivalentes. On a montré que les deux protéines avaient un poids moléculaire et une réactivité immunologique similaires. Aucune glycosylation n’a été détectée. La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et l’analyse de la séquence N-terminale ont permis d’établir l’équivalence de la séquence des deux protéines.

La cassette d’expression du gène tronqué cry1F renferme la séquence codante complète de la protéine Cry1F avec un gène promoteur tronqué et un gène terminateur intact. Le séquençage de 521 paires de bases en amont et de 2059 paires de base en aval de l’insert tronqué a révélé qu’aucun gène endogène du maïs n’est interrompu par l’insert. Le séquençage en amont n’a révélé la présence d’aucune séquence promoteur connue. Une étude menée par Salgueiro et ses collaborateurs (2000) indique que la transcription du gène cry1F pourrait être dirigée par l’intron tronqué du gène de l’ubiquitine présent dans la construction génique.

La transmission héréditaire et la stabilité de chacun des caractères introduits ont été déterminées au moyen d’une combinaison de transferts de Southern, de dosages immunologiques à flux latéral de la protéine Cry1F exprimée et d’épreuves biologiques sur la tolérance à l’herbicide par rapport à la protéine BARM exprimée.

La stabilité génétique de l’insert à une étape précise du processus de sélection (génération BC4S1) et le lien entre le génotype et l’expression du caractère phénotypique ont été démontrés. La stabilité de l’insert a également été confirmée sur deux autres générations. Des analyses de ségrégation ont été réalisées sur quatre autres générations pour évaluer la transmission héréditaire des caractères de résistance aux insectes et de tolérance aux herbicides.

Les résultats de l’analyse confirment la présence d’un seul site d’insertion actif qui se transmet selon les lois de la génétique mendélienne.

Dow AgroSciences Canada Inc. a fourni à l’ACIA une méthode pour détecter et identifier le maïs mis au point à partir de la lignée DAS-06275-8.

L’ACIA a évalué les renseignements fournis par Dow AgroSciences Canada Inc. en ce qui concerne le potentiel reproductif et la capacité de survie des hybrides de maïs issus de la lignée DAS-06275-8 et a conclu que la vigueur végétative, la précocité de maturation et la production de graines se comparent à la gamme de caractères s’exprimant actuellement chez les hybrides de maïs commerciaux.

Aucun avantage compétitif n’a été conféré à ces végétaux, outre ceux conférés par la résistance aux insectes visés et la tolérance au glufosinate-ammonium. Or, il a été démontré que ces caractères ne peuvent faire que la plante se comporte comme une mauvaise herbe ou devienne envahissante dans les milieux naturels, puisque aucun caractère ayant trait à la reproduction ou à la croissance n’a été modifié.

À la lumière de ce qui précède et du fait que les caractères nouveaux ne rendent manifestement pas le végétal nuisible ou envahissant, l’ACIA conclut que le risque que la lignée de maïs DAS-06275-8 se comporte en mauvaise herbe ou devienne envahissante n’est pas plus grand que chez les variétés de maïs actuellement commercialisées.

Certains éléments génétiques insérés dans le génome de la lignée DAS-06275-8 proviennent de Agrobacterium tumefaciens, mais aucun des gènes responsables du pouvoir pathogène de la bactérie n’a été introduit. Par conséquent, l’introduction de ce matériel génétique ne devrait pas entraîner l’expression de caractéristiques de pathogénicité nouvelles chez la lignée DAS-06275-8.

L’ACIA estime par conséquent que la lignée DAS-06275-8 ne présente aucun risque accru de devenir un végétal nuisible.

La protéine Cry1F de B.t. produite par la lignée de maïs DAS-06275-8 n’agit que sur certaines espèces de lépidoptères; aucun lépidoptère figurant sur la liste des espèces canadiennes menacées ou en danger de disparition ne sera exposé de manière significative à la protéine Cry1F produite par la culture à grande échelle du maïs issu de la lignée DAS-06275-8.

La protéine Cry1F exprimée dans la lignée DAS-06275-8 est identique à la protéine Cry1F exprimée dans une lignée de maïs approuvée antérieurement, la lignée 1507. Le pollen et les grains sont des sources possibles d’exposition d’organismes non visés à la protéine Cry1F exprimée dans le maïs. L’expression de la protéine Cry1F dans le pollen est de trois à six fois moins importante que dans la lignée 1507. L’expression de la protéine Cry1F dans les grains est similaire dans les deux lignées. On sait que la protéine Cry1F se dégrade rapidement dans le sol.

Les résultats d’études de toxicité alimentaire chez des organismes non visés présentés à l’appui de la demande d’approbation de la lignée 1507 ont montré que la protéine Cry1F, ingérée à des doses nettement supérieures aux niveaux d’exposition associés aux tissus de maïs de la lignée 1507, n’avait aucun effet sur l’abeille domestique, la larve de la chrysope verte, les coccinellidés, la daphnie, le collembole, les hyménoptères parasites, le ver de terre, le colin de Virginie et la souris. Il a également été démontré que la protéine Cry1F n’était pratiquement pas toxique pour la larve de monarque, même à des doses de 10 mg de toxine/ml de nourriture, un niveau qui dépasse largement l’exposition prévue dans le milieu, selon les données des essais sur le terrain. Étant donné que l’expression de la protéine dans le pollen de la lignée 6575 est nettement moins élevée que dans la lignée 1507, les marges de sécurité de la lignée DAS-06275-8 sont plus grandes que celles de la lignée 1507.

De plus, Dow AgroSciences Canada Inc. a présenté les résultats d’une nouvelle étude de toxicité alimentaire chez la truite arc-en-ciel. Aucune mortalité ni effet sublétal n’a été observé après que des poissons ont été nourris pendant huit jours avec une moulée ordinaire contenant 100 mg de protéine Cry1F par kg de nourriture. Ces résultats confirment l’innocuité de la lignée DAS-06275-8 chez le poisson.

Le caractère de tolérance à l’herbicide du maïs de la lignée DAS-06275-8 lui est conféré par l’expression de la phosphinothricine N-acétyltransférase (BAR). Une étude faisant appel au gavage intensif de souris a permis d’évaluer la toxicité de la protéine BAR. Aucune mortalité ni observations cliniques anormales n’ont été enregistrées pendant les deux semaines de l’expérience au cours de laquelle les souris ont reçu une dose de 3250 mg de protéine BARM par kg de poids corporel. Les enzymes phosphinothricines N-acétyltransférases, dont la protéine BARM exprimée dans la lignée DAS-06275-8, ont fait l’objet de nombreuses études qui ont montré qu’elles pouvaient être utilisées sans danger dans l’alimentation des humains et des animaux.

Le maïs ne produit pas de concentrations significatives de toxines endogènes et l’événement de transformation dont la lignée DAS-06275-8 est issue ne devrait pas être de nature à induire leur synthèse. On sait cependant que le maïs produit de faibles concentrations de l’inhibiteur de la trypsine et d’acide phytique. Il a été établi que la lignée DAS-06275-8 présentait des concentrations équivalentes à celle des lignées témoins et que la modification génétique n’a pas modifié l’expression des toxines endogènes.

L’ACIA estime par conséquent que la dissémination en milieu ouvert de la lignée DAS-06275-8 n’entraînera pas d’effet différent sur les organismes non visés, comparativement aux variétés de maïs actuellement commercialisées.

La lignée de maïs DAS-06275-8 cible certaines espèces de lépidoptères nuisibles, mais il a été démontré que cette lignée est sans danger pour les organismes non visés. La répression des organismes nuisibles aux cultures est une pratique courante au Canada, et elle ne se limite pas à la dissémination de VCN dans l’environnement; par conséquent, la réduction des populations locales d’espèces nuisibles résultant de la dissémination de la lignée de maïs DAS-06275-8 ne constitue pas un changement important par rapport aux pratiques agricoles existantes.

L’utilisation d’herbicides à large spectre vise spécifiquement à réduire les populations de mauvaises herbes dans les champs agricoles, ce qui peut entraîner une réduction locale de la biodiversité de ces espèces ainsi que des espèces d’autres niveaux trophiques qui les exploitent. Il faut noter cependant que cette réduction de la biodiversité des mauvaises herbes dans les champs agricoles n’est pas propre à l’utilisation de cultures tolérantes aux herbicides, et qu’il s’agit au contraire d’une conséquence commune de presque tous les systèmes modernes d’agriculture.

L’ACIA en conclut que l’impact possible de la lignée de maïs DAS-06275-8 sur la biodiversité n’est pas très différent de celui de variétés de maïs actuellement cultivées au Canada.

Le plan suivant de GRI vise à réduire ou du moins à retarder l’acquisition d’une résistance à la protéine Cry1F chez la pyrale du maïs. Un des volets du plan de GRI consiste à aménager un refuge de maïs sensible à la pyrale du maïs à l’intérieur ou en périphérie du champ où le maïs de la lignée DAS-06275-8 sera cultivé. Ainsi, si des insectes devaient acquérir une résistance au maïs B.t., ils pourraient s’accoupler avec des insectes sensibles, ce qui contribuerait à réduire la fréquence des gènes de résistance au sein de la population d’insectes.

L’ACIA estime que des pratiques de saine gestion ainsi que des stratégies de GRI judicieuses peuvent considérablement limiter et retarder l’émergence de populations de pyrale du maïs résistantes à la protéine Cry1F. Les populations de pyrale du maïs doivent cependant faire l’objet d’une surveillance régulière et continue aux fins de la détection précoce des cas de résistance. L’ACIA tient pour acquis que Dow AgroSciences Canada Inc. a élaboré et mettra en œuvre un plan de GRI comportant les éléments essentiels suivants :

Nota : La lignée de maïs DAS-06275-8 cible également le ver de l’épi, la légionnaire d’automne et le vers gris-noir. Il n’est toutefois pas nécessaire de modifier le présent plan de GRI par rapport à la possibilité de résistance chez ces ravageurs, parce que leurs populations hivernantes sont rares au Canada.

Le Bureau de la biosécurité végétale vérifie périodiquement la conformité aux exigences en matière de GRI.

La composition nutritionnelle des grains et des plantes entières de la lignée TCDAS-06275-8 a été comparée à celle d’une lignée témoin à patrimoine génétique semblable. L’analyse de la plante entière a porté sur la détermination de la teneur des éléments suivants : macronutriments, ADF, NDF, Ca et P, et celle du grain, sur celle de ces éléments : principaux acides gras, acides aminés, vitamine A, acide folique, tocophérols, vitamines B, minéraux, métabolites secondaires (inositol, raffinose, furfural, acide p-coumarique et acide férulique) et facteurs antinutritionnels (acide phytique et inhibiteur de la trypsine). Comparativement au témoin, on a constaté dans les grains de la lignée TCDAS-06275-8 une teneur beaucoup plus faible en phosphore, mais toutes les valeurs se rapprochaient de celles indiquées dans la littérature. En revanche, bien que les mesures concernant le calcium, la vitamine A et les tocophérols totaux aient été similaires pour l’ensemble des traitements, elles se situaient à l’extérieur des plages de valeurs publiées dans la littérature.

Métabolites secondaires et facteurs antinutritionnels

Les concentrations d’inositol, de raffinose, de furfural, d’acide p-coumarique, d’acide férulique, d’acide phytique et d’inhibiteur de la trypsine étaient équivalentes dans les grains de maïs provenant de la lignée DAS-06275-8 et ceux des lignées témoins.

Le demandeur a montré que la composition nutritionnelle du maïs de la lignée DAS-06275-8 était équivalente à celles du maïs des lignées témoins.

L’enzyme PAT est hautement spécifique de son substrat et a été bien définie. L’exposition à la protéine PAT n’est pas nouvelle. Le gène bar a été isolé d’une bactérie courante dans le sol, Streptomyces hygroscopicus. Ce gène est présent dans le milieu et n’a pas d’effet nuisible connu sur les humains et les animaux. De plus, la protéine PAT codée par le gène bar est exprimée dans diverses plantes cultivées autorisées au Canada. La protéine PAT codée par le gène bar ne présente aucune homologie importante pertinente sur le plan biologique avec des toxines ou des allergènes connus. Les études indiquent que la protéine est instable lorsqu’elle est exposée à la chaleur ou à un pH faible. Elle devient inactive en une minute lorsqu’elle est soumise aux conditions qui règnent normalement dans l’estomac et l’intestin des mammifères. Une étude de la toxicité orale aiguë chez la souris portant sur la protéine PAT d’origine bactérienne n’a révélé aucun effet nocif de la protéine à une concentration de 3250 mg/kg de poids corporel.

D’après les renseignements fournis par Dow AgroSciences Canada Inc., les protéines Cry1F et PAT sont peu susceptibles de se comporter comme des toxines ou des allergènes. Selon les niveaux d’exposition prévus et les résultats des épreuves susmentionnées, l’exposition aux protéines Cry1F et PAT ne devrait pas présenter de risque significatif pour le bétail ni pour les travailleurs ou des tiers.

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