Directed microspore-specific recombination of transgenic alleles to prevent pollen-mediated transmission of transgenes
Ludmila Mlynárová, Anthony J. Conner and Jan-Peter Nap

SUMMARY

A major challenge for future genetically modified (GM) crops is to prevent undesired gene flow of transgenes to plant material intended for another use. Recombinase-mediated auto excision of transgenes directed by a tightly controlled microspore-specific promoter allows efficient removal of either the selectable marker gene or of all introduced transgenes during microsporogenesis. This way, transgene removal becomes an integral part of the biology of pollen maturation, not requiring any external stimulus such as chemical induction by spraying. We here show the feasibility of engineering transgenic plants to produce pollen devoid of any transgene. Highly efficient excision of transgenes from tobacco pollen was achieved with a potential failure rate of at most two out of 16 800 seeds (0.024%). No evidence for either premature activation or absence of activation of the recombinase system was observed under stress conditions in the laboratory. This approach can prevent adventitious presence of transgenes in non-GM crops or related wild species by gene flow. Such biological containment may help the deployment and management of coexistence practices to support consumer choice and will promote clean molecular farming for the production of high-value compounds in plants.

Source: http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1467-7652.2006.00194.x

Wageningen, The Netherlands
June, 2006

RELATED ARTICLE FROM Wb #20, weekly newspaper for Wageningen UR

Transgenes in plant, but not in pollen

Researchers in Wageningen have developed a new method in which a genetically modified plant destroys its transgenes once it has manufactured its pollen. This makes it possible to avoid the spread of transgenes, and to use plants as molecular factories in a cleaner way.

‘It seems to be a very elegant technique. What it comes down to is that, in addition to the genes that we introduce, there is also a gene that ensures that all the transgenes are thrown out once the plant starts to make pollen. To do this we linked the gene to a promoter, a genetic switch, that is only on while the plant is making pollen,’ says Dr Jan-Peter Nap of Plant Research International. Together with Dr Ludmila Mlynárova, now at the Molecular Biology Group, and a colleague from New Zealand, they will publish their findings in July in Plant Biotechnology Journal.

Nap is aware that many people will associate this technique with the controversial terminator technology, a genetic modification which prevents transgenic plants from making seed. This enables seed companies to make sure that farmers have buy new improved seed each year, instead of using seed they have collected themselves. ‘It is indeed a new kind of GURT – Genetic Use Restriction Technology – which is also what a terminator gene is. But in our case a plant does produce seed, it is only the production of transgenic pollen that is prevented. This is in response to the criticism that transgenes can be transferred to wild relatives or other crops through pollen. In addition, our technique does not require that plants be sprayed with chemicals to turn the switch on or off. We have made the deletion of the transgenes part of the plant’s biology,’ explains Nap.

The new technique makes use of a cre-gene, which can delete genetic material between two markers, the loxP-sites. By using a genetic switch, the promoter NTM19, which is only turned on during the first phase of pollen formation, only the transgenes are removed from the pollen.

Nap and his colleagues started by testing the system in tobacco plants, from which the genetic switch comes originally. Only two out of 16,800 seeds (0.024 per cent) produced from pollen from the transgenic plant still contained transgenes. ‘That is a surprisingly low percentage,’ says Nap. The system is very robust and also works well in the model plant Arabidopsis.
One possible disadvantage is that, because of the absence of transgenes in the pollen, it will be more difficult to maintain pure breeding lines.

Nap expects applications to be found above all in molecular farming, in which plants are used to manufacture pharmaceuticals and health promoting substances. The tobacco plant is very suitable for producing complex substances, but Nap thinks there are opportunities for using crops such as cabbage varieties to manufacture health-promoting omega-3-fatty acids.

Nap does not think that the development will silence criticism from organisations such as Greenpeace. ‘It is a very ‘clean’ process by which the transgenes are removed, but there still are 22 base pairs left over. This is not enough for a plant to manufacture transgenic proteins, but if activists are looking for a target, they will find one in this. After all, it’s still genetic modification.’ / GvM

Techniek voorkomt verspreiding gentech

Wageningse onderzoekers hebben een methode ontwikkeld waardoor een genetisch gemodificeerde plant zijn transgenen verwijdert zodra hij stuifmeel aanmaakt. Dit maakt het mogelijk de verspreiding van transgenen in te dammen en op een schonere manier planten als moleculaire fabriekjes te gebruiken.

‘Het lijkt een hele elegante techniek. Het komt er op neer dat bij de genen die we inbrengen ook een gen zit dat alle transgenen er weer uitgooit zodra de plant pollen gaat vormen. Hiertoe hebben we dat gen gekoppeld aan een promotor – een genetische schakelaar – die echt alleen aanstaat tijdens de stuifmeelaanmaak’, zegt dr. Jan-Peter Nap van Plant Research International. Samen met dr. Ludmila Mlynárova, nu werkzaam bij de leerstoelgroep Moleculaire biologie, en een Nieuw-Zeelandse collega publiceren ze deze benadering deze maand in Plant Biotechnology Journal.

Nap snapt dat deze techniek veel mensen doet denken aan de omstreden terminator-technologie, waarmee via genetische modificatie wordt voorkomen dat transgene planten zaad kunnen maken. Daarmee kunnen veredelingsbedrijven zorgen dat boeren ieder jaar terugkomen om het verbeterde zaad te kopen. ‘Het is inderdaad een nieuwe variant op GURT - Genetic Use Restriction Technology – waar ook de terminator bij hoort. Maar in ons geval kan een plant wel gewoon zaad aanmaken, alleen de productie van transgeen stuifmeel wordt voorkomen. Het komt tegemoet aan de kritiek dat transgenen via pollen in wilde verwanten of andere gewassen terechtkomen. Bovendien is het bij onze techniek niet nodig om de plant te bespuiten met een chemisch stofje om de schakelaar aan of uit te zetten. We hebben het uitgooien van trangenen gewoon onderdeel gemaakt van de biologie van de plant’, aldus Nap.

De nieuwe techniek maakt gebruik van een cre-gen, dat de eigenschap bezit om het genetische materiaal dat zich tussen twee genetische grenspaaltjes – de loxP-sites – te verwijderen. Door nu een genetische schakelaar – de promotor NTM19 – te gebruiken, die alleen aangeschakeld is tijdens de eerste fase van de pollenvorming, worden de transgenen alleen in het stuifmeel verwijderd.

Nap en zijn collega’s hebben het systeem allereerst getest bij tabaksplanten, waaruit de betrokken genetische schakelaar afkomstig is. Slechts twee van de 16800 zaden (0,024 procent) die afkomstig waren van stuifmeel van de transgene plant bleken nog transgenen te bezitten. ‘Een verrassend laag percentage’, aldus Nap. Het systeem is heel robuust en doet het ook uitstekend in de modelplant Arabidopsis (zandraket).

Een mogelijk nadeel is dat het – juist door het ontbreken van transgenen in het stuifmeel – lastiger is een zuivere veredelingslijn te handhaven. Nap voorziet vooral toepassingen in molecular farming, het gebruiken van planten voor de aanmaak van farmaceutica of gezondheidsbevorderende stoffen. De tabaksplant is heel geschikt om ingewikkelde stoffen te produceren, maar Nap ziet ook mogelijkheden voor bijvoorbeeld koolgewassen die de gezonde omega-3-vetzuren aanmaken.

Nap gelooft niet dat de kritiek van organisaties als Greenpeace nu zal verstommen. ‘Het verwijderen van de transgenen gebeurt op een genetisch heel schone manier, maar uiteindelijk blijven er nog 22 baseparen achter. Daarmee kan een plant geen transgene eiwitten meer aanmaken, maar als activisten een stok zoeken, kunnen ze hiermee slaan. Het blijft genetische modificatie.’ / GvM