Canadian Food Inspection Agency
Plant Products Directorate
Plant Biosafety Office
Link: http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd0553e.shtml

Decision Document DD2005-53
Determination of the Safety of Monsanto Canada Inc.’s Roundup Ready® Alfalfa (Medicago sativa L.) Events J101 and J163

This Decision Document has been prepared to explain the regulatory decision reached under Directive 94-08 (Dir94-08), entitled "Assessment Criteria for Determining Environmental Safety of Plants with Novel Traits", its companion biology document Bio2005-02, The Biology of Medicago sativa L. (Alfalfa), and Directive 95-03 (Dir95-03), entitled "Guidelines for the Assessment of Novel Feeds: Plant Sources".

The Canadian Food Inspection Agency (CFIA), specifically the Plant Biosafety Office (PBO) of the Plant Products Directorate and the Feed Section of the Animal Health and Production Division has evaluated information submitted by Monsanto Canada Inc. This information is in regard to the glyphosate tolerant alfalfa events J101 and J163. The CFIA has determined that these plants with a novel trait (PNT) do not present altered environmental risk nor, as a novel feed, do they present livestock feed safety concerns when compared to currently commercialized alfalfa varieties in Canada.

Unconfined release into the environment and use as livestock feed of the alfalfa events J101 and J163 are therefore authorized as of July 28, 2005. Any other alfalfa lines and intraspecific hybrids resulting from the same transformation events and all their descendants, may also be released into the environment and used as livestock feed, provided no inter-specific crosses are performed, provided the intended use is similar, provided it is known, following thorough characterization, that these plants do not display any additional novel traits and are substantially equivalent to currently grown alfalfa, in terms of their potential environmental impact and livestock feed safety.

The J101 and J163 alfalfa events are subject to the same phytosanitary import requirements as their unmodified counterparts.

Please note, that the livestock feed and environmental safety of PNTs and novel feeds are critical steps in the potential commercialization of these plant types. Other requirements, such as the evaluation of food safety by Health Canada, have been addressed separately from this review.

Table of Contents

I. Brief Identification of the Plants with a Novel Trait (PNT)

II. Background Information

III. Description of the Novel Trait

1. Glyphosate Tolerance
2. Development Method
3. Stable Integration into the Plant’s Genome

IV. Assessment Criteria for Environmental Safety

1. Potential of these PNTs to Become a Weed of Agriculture or be Invasive of Natural Habitats
2. Potential for Gene Flow to Wild Relatives Whose Hybrid Offspring May Become More Weedy or More Invasive
3. Altered Plant Pest Potential
4. Potential Impact on Non-Target Organisms
5. Potential Impact on Biodiversity

V. Criteria for Livestock Feed Assessment

1. Potential Impact on Livestock Nutrition
2. Potential Impact on Livestock and Workers/By-Standers

VI. New Information Requirements

VII. Regulatory Decision

I. Brief Identification of the Plants with a Novel Trait (PNT)

II. Background Information

Monsanto Canada Inc., in collaboration with Forage Genetics International (FGI), has developed Roundup Ready® Alfalfa events J101 and J163, containing an epsps gene, coding for 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS). This gene imparts tolerance to glyphosate (the active ingredient in Roundup® herbicide), a novel trait in alfalfa varieties currently cultivated in Canada. This herbicide tolerance trait allows for the control or suppression of economically important weeds in alfalfa production.

The development of the glyphosate tolerant alfalfa events was accomplished with recombinant DNA technology. The epsps coding sequence from the bacterium Agrobacterium sp. strain CP4 (i.e cp4 epsps), was introduced into alfalfa clone R2336. Line R2336 was selected from an elite, high yielding, fall-dormant FGI alfalfa breeding population using a tissue culture screen for callus formation and somatic embryo induction. Resultant calluses which produced the CP4 EPSPS protein were identified by tolerance to exposure to the herbicide glyphosate. The CP4 EPSPS protein imparts reduced sensitivity, in the chloroplast, to glyphosate herbicides. The cp4 EPSPS coding sequence in alfalfa events J101 and J163 is fused to a chloroplast transit peptide (CTP) sequence which directs the translated protein to the chloroplast, the site of amino acid biosynthesis.

If commercialized, Roundup Ready® alfalfa varieties will use two different cp4 epsps insertion events (J101 and J163) combined through a conventional breeding process.

Monsanto Canada Inc. has provided data on the identity of events J101 and J163, a detailed description of the transformation methods, data and information on the gene insertion sites, copy numbers and levels of expression in the plants, the role of the inserted genes and regulatory sequences in donor organisms and the amino acid sequences. Due to the low levels of CP4 EPSPS protein expressed in these alfalfa plants it was necessary to produce CP4 EPSPS protein in a microbial expression system to obtain sufficient quantities of the protein in order to conduct some of the protein characterization studies. References to relevant scientific publications were included.

These plants have been field tested in Canada under confined conditions in Manitoba and Ontario in 2002 and 2001 respectively. Field trials had also been conducted in the USA, between 1998 and 2003.

Agronomic characteristics of Roundup Ready® alfalfa populations containing events J101 and J163, such as forage and seed yield, vegetative vigour, stand longevity and changes in susceptibilities to various pests and diseases, were compared to those of unmodified M. sativa counterparts.

Monsanto Canada Inc. has provided an agronomic stewardship plan for Roundup Ready® alfalfa in the Canadian environment. This plan includes information regarding a safe and sustainable deployment of Roundup Ready® alfalfa and an efficient mechanism for growers to report agronomic problems with this product to Monsanto Canada Inc.

Nutritional components of Ready alfalfa events J101 and J163 such as proximates, amino acids and fatty acids were compared with unmodified alfalfa counterparts.

The Plant Biosafety Office (PBO) of the Plant Products Directorate, CFIA, has reviewed the above information, in light of the assessment criteria for determining environmental safety of PNTs, as described in the Directive 94-08 (Dir94-08), entitled "Assessment Criteria for Determining Environmental Safety of Plants With Novel Traits". The PBO has considered:

• potential of the PNTs to become weeds of agriculture or be invasive of natural habitats,
• potential for gene flow to wild relatives whose hybrid offspring may become more weedy or more invasive,
• potential for the PNTs to become plant pests,
• potential impact of the PNTs or their gene products on non-target species, including humans, and
• potential impact on biodiversity.

The Feed Section of the Animal Health and Production Division, CFIA, has also reviewed the above information with respect to the assessment criteria for determining the safety and efficacy of livestock feed, as described in Directive 95-03 (Dir95-03), entitled "Guidelines for the Assessment of Novel Feeds: Plant Sources". The Feed Section has considered:

• potential impact to livestock and workers/by-standers; and,
• potential impact on livestock nutrition.

III. Description of the Novel Trait

1. Glyphosate Tolerance

• A gene derived from an Agrobacterium sp. strain CP4 (cp4 epsps) which imparts field level tolerance to glyphosate, the active ingredient in Roundup® agricultural herbicides, was introduced into alfalfa to produce events J101 and J163.

• An optimized chloroplast transit peptide isolated from Arabidopsis thaliana was fused to the cp4 epsps coding sequence. This peptide facilitates the import of the newly translated EPSPS enzyme into the chloroplast, the site of amino acid biosynthesis.

• The inserted gene codes for 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), an enzyme involved in the shikimic acid metabolic pathway which is essential for the production of the aromatic amino acids. The native alfalfa EPSPS enzyme is inhibited by glyphosate. The herbicide disrupts the shikimic acid pathway, leading to growth suppression or death of the plant. The bacterial CP4 EPSPS version of this enzyme, expressed in alfalfa events J101 and J163, is not inhibited by glyphosate and continues to catalyze the production of aromatic amino acids in the presence of glyphosate. The expression of the novel enzyme in the plant was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

• A gene coding for CP4 EPSPS was introduced and expressed in the bacterial species E. coli and the protein was shown to be biologically, chemically and functionally equivalent to the CP4 EPSPS protein produced in the alfalfa plant. Due to the low levels of CP4 EPSPS in the alfalfa plant tissue E. coli produced CP4 EPSPS was used to generate sufficient quantities of pure protein for safety studies. References to relevant scientific publications were included.

• The CP4 EPSPS protein was found to be labile to mammalian digestion. The data demonstrated a half-life for CP4 EPSPS protein of less than 15 seconds in simulated gastric fluid (pepsin) and within 10 minutes in simulated intestinal fluid. Results were shown on western blots.

• An acute mouse gavage study demonstrated that the CP4 EPSPS is not toxic. No treatment-related adverse effects were observed in animals administered CP4 EPSPS protein by oral gavage at doses up to 475 mg/kg body weight.

• The amino acid sequence of the CP4 EPSPS protein shares no structurally significant sequence similarity to known toxins and allergens. EPSPS is an enzyme present in many foods with a long history of safe use in Canada, and therefore the CP4 EPSPS form is not be expected to be toxic or allergenic.

2. Development Method

Roundup Ready® alfalfa events J101 and J163 were generated using Agrobacterium-mediated transformations of alfalfa callus (from alfalfa line R2336). A double border, binary vector, designated as PV-MSHT4, containing the epsps gene from the Agrobacterium sp. strain CP4 (CP4 EPSPS) was used. The cp4 epsps expression cassette contains the cp4 epsps coding sequence under the regulation of the figwort mosaic virus (FMV) promoter, a heat shock protein intron (HSP70), a chloroplast transit peptide (CTP2) sequence and a E9 3’ polyadenylation sequence. Glyphosate tolerant transformed calluses were selected for elevated levels of glyphosate tolerance through the addition of glyphosate to the plant tissue culture media, then cultured in tissue culture medium for plant regeneration.

3. Stable Integration into the Plant Genome

Both events contain a single copy of the cp4 epsps gene cassette at a single locus of integration. The cp4 epsps gene cassette for both events is intact. No additional elements from the transformation vector PV-MSHT4 were detected in Roundup Ready® events J101 and J163. These data, generated through Southern blot analyses, support the conclusion that only the expected, full length CP4 EPSPS protein is encoded by the inserts in Roundup Ready® events J101 and J163.

Stability analysis for Roundup Ready® alfalfa events J101 and J163 has demonstrated that each event was observed to be stable in the initial generation transformed, subsequent outcrosses and the combination of events J101 and J163 through conventional breeding.

IV. Assessment Criteria for Environmental Safety

1. Potential of the PNT to Become a Weed of Agriculture or be Invasive of Natural Habitats

The biology of alfalfa (Medicago sativa L.) as described in Biology Document Bio2005-02, "The Biology of Medicago sativa L.", shows that unmodified plants of this species are not invasive of unmanaged habitats in Canada. There is no evidence in Canada that M. sativa has weed or pest characteristics. According to the information provided by Monsanto Canada, Inc., events J101 and J163 were determined not to be different from their unmodified counterparts in this respect.

The CFIA evaluated data submitted by Monsanto Canada Inc. on the reproductive and survival biology of alfalfa events J101 and J163, and determined that stand establishment, enhanced growth, vigour or stand longevity; changes in susceptibility to plant pests and diseases common to alfalfa; increases in forage and seed yield and increases in seed dormancy were within the normal range of expression of these traits currently displayed by commercial alfalfa varieties.

No competitive advantage was conferred to these plants, other than that conferred by tolerance to glyphosate herbicide. Tolerance to Roundup® agricultural herbicides will not, in itself, render alfalfa weedy or invasive of natural habitats since none of the reproductive or growth characteristics were modified.

The above considerations, together with the fact that the novel traits have no intended effects on alfalfa weediness or invasiveness, led the CFIA to conclude that alfalfa events J101 and J163 have no altered weed or invasiveness potential compared to currently commercialized alfalfa.

The agronomic stewardship plan, which contains a herbicide tolerance management plan, submitted by Monsanto Canada Inc. was evaluated by the CFIA and determined to be satisfactory. The herbicide tolerant stewardship plan includes recommendations on agricultural practices concerning Roundup Ready® alfalfa and provides an efficient mechanism for growers to report agronomic problems with this product to Monsanto Canada Inc., facilitating the ongoing monitoring of Roundup Ready® alfalfa.

A longer term consideration, if there is general adoption of several different crop species and specific herbicide weed management systems (ie. numerous combinations of crop species and tolerances to different herbicides), is the potential development of crop volunteers with a combination of novel tolerances to different herbicides. This could result in the loss of the use of these herbicides and any of their potential benefits. Therefore, Monsanto Canada Inc. will make their stewardship plan readily available to growers and agriculture extension personnel, in both private and public sectors, to promote the careful management practices, such as use of alternate control tools as appropriate to achieve complete control, recommended to help minimize the development of resistant weed populations.

2. Potential for Gene Flow to Wild Relatives Whose Hybrid Offspring May Become More Weedy or More Invasive

The biology of alfalfa, as described in Bio2005-02, indicates that the only wild relative occurring in Canada is M. lupulina. It has been reported that hybrids of M. lupulina and M. sativa are considered impossible, or exceedingly unlikely, to occur in nature.

The CFIA therefore concludes that gene flow from alfalfa events J101 and J163 to wild relatives of alfalfa is highly unlikely in Canada.

3. Altered Plant Pest Potential

The intended effect of the novel trait is unrelated to plant pest potential, and alfalfa is not considered a plant pest in Canada (Bio2005-02). In addition, agronomic characteristics of the modified alfalfa populations were shown to be within the range of values displayed by currently commercialized alfalfa varieties, and indicate that the growing habit of alfalfa was not inadvertently altered. Volunteer alfalfa containing glyphosate tolerance, originating from previous crop years or cross pollination (i.e. wind or bee mediated), can still be managed by growers through the use of alternative herbicides with different modes of action, or cultivation practices which do not involve the use of herbicides. Field observations did not indicate modifications of disease and pest susceptibilities.

The CFIA has therefore determined that the events J101 and J163 do not display any altered pest potential.

4. Potential Impact on Non-Target Organisms

The detailed characterization of the novel gene and resulting enzyme, as briefly summarized in Part III of the present document, has led to the conclusion that the expression of the novel protein does not result in altered toxic or allergenic properties. The EPSPS protein is not a known toxin and is commonly found in a wide variety of plants and micro-organisms with a history of safe use. Additionally, acute mouse gavage tests demonstrated the lack of acute oral toxicity of the EPSPS protein.

Based on the above, the CFIA has determined that the unconfined release of alfalfa events J101 and J163 will not result in altered impacts on interacting organisms, including humans, compared to current alfalfa varieties.

5. Potential Impact on Biodiversity

Events J101 and J163 express no novel phenotypic characteristics which could extend its use beyond the current geographic range of alfalfa production in Canada. Since alfalfa does not outcross to wild relatives in Canada, with the possible exception to feral alfalfa populations, there will be no transfer of novel traits to related species in unmanaged environments. In addition the novel trait was determined to pose minimal risks to non-target organisms.

The CFIA has therefore concluded that the potential impact on biodiversity of alfalfa events J101 and J163 is equivalent to that of currently commercialized alfalfa varieties.

V. Criteria for Livestock Feed Assessment

1. Potential Impact on Livestock Nutrition

Alfalfa for the compositional analysis was obtained from 5 replicated field sites across the United States from second cut forage. Four commercially available varieties were also grown at each site (12 commercial varieties in total). Forage samples were collected from all plots and analyzed for nutritional components.

Compositional analyses of forage samples included protein, fat, ash, moisture, ADF, NDF, lignin, amino acids, Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, P, N, K, Na, Zn and carbohydrates. Events J101, J163 and J101 x J163 were compared to a non-transgenic control and further compared to 12 commercial varieties. Statistical differences were observed with respect to select amino acids, NDF and sodium however the variation was attributed to normal variability rather than the inserted novel traits.

CFIA has determined that Roundup Ready alfalfa containing event J101, J163 or J101 x J163 is nutritionally equivalent to non-transgenic alfalfa and similar to commercial varieties grown in North America.

2. Potential Impact on Livestock and Workers/By-standers

EPSPS is an enzyme present in many foods with a long history of safe use in Canada, and therefore would not be expected to be toxic or allergenic. The CP4 EPSPS enzyme is from Agrobacterium strain CP4, a soil bacterium, which is not a known human or animal pathogen. The amino acid sequence of the CP4 EPSPS protein found in events J101 and J163 is identical to the CP4 EPSPS protein in Roundup Ready™ crops previously approved in Canada. CP4 EPSPS shares no biologically relevant significant homology with known toxins or allergens, it is present in small amounts in the feed, it is heat labile and it is rapidly degraded under conditions in the gastrointestinal tract. Additionally, a mouse acute oral toxicity study showed a NOEL of 475 mg/kg CP4 EPSPS. Based on the information provided by Monsanto Canada, CP4 EPSPS is unlikely to be a novel toxin or allergen.

Based on the predicted exposure levels and the results of the above tests, no significant risk to livestock and workers/by-standers is expected from exposure to the CP4 EPSPS protein.

VI. New Information Requirements

If at any time, Monsanto Canada Inc. becomes aware of any information regarding risk to the environment, including risk to human or animal health, that could result from the release in Canada or elsewhere of alfalfa events J101 and J164, their descendants, or products derived there from, Monsanto Canada, Inc. must immediately provide such information to the CFIA. On the basis of such new information, the CFIA will re-evaluate the potential impact of the proposed feed use and environmental release and will re-evaluate its decision with respect to the livestock feed use and environmental release authorizations of this alfalfa line.

VII. Regulatory Decision

Based on the review of the data, information and stewardship plan submitted by Monsanto Canada, Inc., and through comparisons of Roundup Ready® alfalfa events J101 and J163 with unmodified alfalfa counterparts, the PBO of the Plant Products Directorate, CFIA, has concluded that the novel gene and its corresponding trait does not confer to these plants any characteristic that would result in unintended environmental effects following unconfined release.

Based on the review of submitted data and information, the Feed Section of the Animal Health and Production Division has concluded that the novel trait does not in itself raise any concerns regarding the safety or nutritional composition of events J101 and J163. Alfalfa forage and its by-products are currently listed in Schedule IV of the Feeds Regulations and are therefore approved for use in livestock feeds in Canada. Events J101 and J163 have been assessed and found to be substantially equivalent to traditional alfalfa varieties. Events J101 and J163 and its by-products are considered to meet present ingredient definitions and are approved for use as livestock feed ingredients in Canada.

Unconfined release into the environment and use as livestock feed of alfalfa events J101 and J163 is therefore authorized as of July 28, 2005. Any other alfalfa varieties and intra-specific hybrids resulting from the same transformation event and all their descendants, may also be released into the environment and used as livestock feed, provided no inter-specific crosses are performed, provided the intended use is similar, provided it is known following thorough characterization that these plants do not display any additional novel traits and are substantially equivalent to currently grown alfalfa, in terms of their potential environmental impact and livestock feed safety and efficacy.

The alfalfa events J101 and J163 are subject to the same phytosanitary import requirements as its unmodified counterparts.

Please refer to Health Canada’s Decisions on Novel Foods for a description of the food safety assessment of alfalfa events J101 and J163. The food safety decisions are available at the following Health Canada web site: http://www.hc sc.gc.ca/food aliment/english/subjects/novel_foods_and_ingredient/novel_foods_and_ingredient.html

This bulletin is published by the Plant Products Directorate and the Animal Health and Production Division. For further information, please contact the Plant Biosafety Office or the Feed Section at:

Agence canadienne d'inspection des aliments
Direction des produits végétaux
Bureau de la biosécurité végétale
Link: http://www.inspection.gc.ca/francais/plaveg/bio/dd/dd0553f.shtml

Document de décision DD2005-53
Détermination de l'innocuité des lignées J101 et J163 de luzerne (Medicago sativa L.) Roundup Ready® de Monsanto Canada Inc.

Le présent document de décision vise à expliquer la décision réglementaire prise conformément à la directive 94-08 (Dir94-08), Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux, au document de biologie Bio2005-02, La biologie du Medicago sativa L. (luzerne), et à la directive 95-03 (Dir95-03), Directive relative à l'évaluation des aliments nouveaux du bétail : Origine végétale.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA), plus précisément le Bureau de la biosécurité végétale (BBV) de la Direction des produits végétaux et la Section des aliments du bétail de la Division de la santé des animaux et de l'élevage, a évalué les données présentées par la société Monsanto Canada Inc. relativement aux lignées J101 et J163 de luzerne tolérant l'herbicide glyphosate. L'ACIA a établi que ces végétaux à caractères nouveaux (VCN) ne présentent aucune interaction environnementale modifiée ni aucun danger pour le bétail consommant des aliments dérivés de ces VCN, par rapport aux variétés de luzerne déjà commercialisées au Canada.

La dissémination en milieu ouvert des lignées J101 et J163 de luzerne, y compris leur utilisation comme aliment du bétail, est par conséquent autorisée à compter du 28 juillet, 2005. Toute autre lignée et tout hybride intraspécifique de luzerne qui seraient issus de la même transformation, ainsi que tous leurs descendants, peuvent également être disséminés dans l'environnement et utilisés comme aliments du bétail, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie ait démontré que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau et que les lignées qui en résultent sont essentiellement équivalentes aux variétés de luzerne déjà cultivées, quant à leur impact potentiel sur l'environnement et à leur innocuité comme aliments du bétail.

Les lignées J101 et J163 de luzerne sont soumises aux mêmes exigences phytosanitaires que leurs contreparties non modifiées.

À noter que la détermination de l'innocuité pour les aliments du bétail et l'environnement des VCN et des nouveaux aliments du bétail sont des étapes importantes de la mise en marché éventuelle de ces types de végétaux. L'évaluation du VCN quant à son innocuité comme aliment pour la consommation humaine relève de Santé Canada et fait l'objet d'un document distinct.

Table des matières

I. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)

II. Renseignements de base

III. Description du caractère nouveau

1. Tolérance au glyphosate
2. Méthode de mise au point
3. Stabilité de l'intégration au génome de la plante

IV. Critères d'évaluation du risque environnemental

1. Possibilité que les VCN se comportent comme une mauvaise herbe pour l'agriculture ou envahissent les milieux naturels
2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement
3. Possibilité que les VCN deviennent nuisibles
4. Impact possible sur les organismes non visés
5. Impact possible sur la biodiversité

V. Critères d'évaluation comme aliments pour bétail

1. Impact(s) possible sur la nutrition du bétail
2. Impact potentiel sur les animaux et impact lié à une exposition professionnelle ou fortuite chez les humains

VI. Nouveaux renseignements requis

VII. Décision réglementaire

I. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)

II. Renseignements de base

La société Monsanto et Forage Genetics International (FGI) ont créé les lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready®, renfermant un gène epsps codant la 5 énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase (EPSPS). Ce gène confère à ces lignées une tolérance au glyphosate (matière active de l'herbicide Roundup®), un caractère nouveau aux variétés de luzerne cultivées au Canada actuellement. Cette nouvelle tolérance permet de combattre ou d'éliminer certaines mauvaises herbes d'importance économique dans la production de luzerne.

Les lignées de luzerne tolérant le glyphosate ont été mises au point par la technique de l'ADN recombinant. La séquence codante epsps de la souche bactérienne CP4 d'Agrobacterium sp. (cp4 epsps) a été introduite dans le clone de luzerne R2336. La lignée R2336 a été sélectionnée à partir d'une population de luzerne FGI élite à haut rendement, dormante à l'automne, par criblage de cellules cultivées à la recherche de la formation de cals et de l'induction d'embryons somatiques. Les cals résultants qui produisaient la protéine CP4 EPSPS ont été identifiés par leur tolérance à l'exposition au glyphosate. La protéine CP4 EPSPS réduit la sensibilité de la cellule au glyphosate, la matière active des herbicides agricoles de type Roundup®, dans le chloroplaste. La séquence codante cp4 epsps dans les lignées J101 et J163 de luzerne est fusionnée à la séquence codant un peptide chloroplastique de transport, ce qui a pour effet de diriger la protéine CP4 EPSPS vers le chloroplaste, où a lieu la synthèse des acides aminés.

Si mises en marché, les variétés de luzerne Roundup Ready® comprendront deux insertions différentes du gène cp4 epsps (J101 et J163) dans le cadre d'un processus de reproduction classique.

Monsanto Canada Inc. a fourni des données sur l'identité des lignées J101 et J163, une description détaillée de la méthode de transformation ainsi que des données et de l'information sur le site d'insertion du gène nouveau, sur le nombre de copies et le degré d'expression de ce gène chez ces VCN, sur le rôle de ce gène et de ses séquences régulatrices chez les organismes donneurs ainsi que sur la séquence d'acides aminés de la protéine produite. Étant donné les faibles concentrations de la protéine CP4 EPSPS exprimée dans le plant de luzerne, il s'est révélé nécessaire de produire la protéine CP4 EPSPS par fermentation bactérienne pour obtenir une quantité suffisante de cette protéine pour effectuer certaines des études d'innocuité. Des références à des publications scientifiques pertinentes ont été fournies.

Ces lignées ont fait l'objet d'essais au champ dans des conditions confinées en 2002 au Manitoba et en 2001 en Ontario. Des essais au champ ont également été réalisés aux É. U. entre 1998 et 2003.

Certaines caractéristiques agronomiques des populations de luzerne Roundup Ready® contenant les lignées J101 et J163, comme le rendement en fourrage et en graines; la dormance, la vigueur végétative ou la longévité des peuplements; les changements au niveau de la sensibilité à divers organismes nuisibles et maladies, ont été comparées à celles de contreparties de M. sativa non modifiées.

Monsanto Canada Inc. a fourni un plan de gestion agronomique pour la culture de lignées de luzerne Roundup Ready® dans l'environnement canadien. Ce plan de gestion comprend des informations au sujet de la culture durable et sécuritaire de la luzerne Roundup Ready®, ainsi qu'un mécanisme efficace permettant aux producteurs de signaler à la société Monsanto de problèmes agronomiques survenus lors de la culture de ce produit végétal.

Les composantes nutritionnelles des lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready®, comme les grands groupes de composants, les acides aminés et les acides gras, ont aussi été comparées à celles des lignées de luzerne non modifiées.

Le Bureau de la biosécurité végétale (BBV) de la Direction des produits végétaux de l'ACIA a examiné les renseignements susmentionnés à la lumière des critères suivants servant à l'évaluation du risque environnemental associé aux VCN, lesquels critères sont énoncés dans la Directive 94-08 (Dir94-08), intitulée " Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux " :

• possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaise herbe pour l'agriculture ou envahisse les milieux naturels;
• possibilité de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement;
• possibilité que le VCN devienne nuisible;
• impact possible du VCN ou de ses produits géniques sur des espèces non visées, y compris l'être humain;
• impact possible sur la biodiversité.

La Section des aliments du bétail de la Division de la santé des animaux et de l'élevage de l'ACIA a également étudié l'information fournie à la lumière des critères suivants servant à l'évaluation de l'innocuité et de l'efficacité des aliments du bétail, lesquels critères sont énoncés dans la directive 95-03 (Dir95-03), intitulée " Directive relative à l'évaluation des aliments nouveaux du bétail : Origine végétale " :

• effets possibles sur le bétail lui-même;
• effets possibles sur la nutrition du bétail.

III. Description du caractère nouveau

1. Tolérance au glyphosate

• Le gène cp4 epsps, qui est issu de la souche CP4 d'Agrobacterium sp. et confère une tolérance au champ au glyphosate (la matière active de l'herbicide Roundup®) a été introduit dans la luzerne afin de produire les lignées J101 et J163.

• Une séquence d'origine végétale codant une version optimisée d'un peptide chloroplastique de transport en provenance d'Arabidopsis thaliana a été fusionnée à la séquence codante cp4 epsps. Ce peptide aide l'enzyme EPSPS nouvellement traduite à pénétrer dans les chloroplastes, où la synthèse des acides aminés a lieu.

• Le gène introduit code la 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase (EPSPS), une enzyme qui joue un rôle dans la voie shikimique du métabolisme, laquelle est essentielle à la biosynthèse des acides aminés aromatiques. L'enzyme EPSPS que produit naturellement la luzerne est sensible au glyphosate. Cet herbicide a pour effet de bloquer la voie shikimique, ce qui entraîne la mort de la plante ou une interruption de sa croissance. Les lignées J101 et J163 produisent la variante CP4 EPSPS de l'enzyme, qui leur confère une tolérance au glyphosate, puisqu'elles continuent de catalyser la synthèse des acides aminés aromatiques malgré la présence de glyphosate. L'expression de la nouvelle enzyme dans le végétal a été mesurée par dosage immunoenzymatique (ELISA).

• Un gène codant la protéine CP4 EPSPS a été introduit et exprimé dans E. coli. La protéine CP4 EPSPS exprimé dans E. coli a été évaluée préalablement d'être biologiquement, chimiquement et fonctionnellement équivalente à la protéine CP4 EPSPS produite chez le plant de luzerne. Étant donné que le niveau d'expression de la protéine CP4 EPSPS chez les végétaux est faible, la protéine CP4 EPSPS produite par E. coli a été utilisée pour produire des quantités suffisantes de protéine pure pour les études d'innocuité. Des références à des publications scientifiques pertinentes ont été fournies

• La protéine EPSPS s'est révélée labile à la digestion mammalienne. Les données ont révélé que la protéine CP4 EPSPS a une demi vie de moins de 15 secondes dans un milieu simulant le suc gastrique (pepsine) et de moins de 10 minutes dans un milieu simulant le liquide intestinal. Les résultats ont été obtenu par transfert de Western.

• Une étude aiguë par gavage chez des souris a montré que la CP4 EPSPS n'est pas toxique. Aucun effet négatif imputable au traitement n'a été observé chez les animaux auxquels on avait administré, par gavage oral, jusqu'à 475 mg/kg poids corporel.

• La séquence d'acides aminés de la protéine CP4 EPSPS n'affiche aucune homologie structurelle appréciable avec des toxines, allergènes ou gliadines connus. Comme l'enzyme EPSPS est présente dans de nombreux aliments qui sont depuis longtemps consommés sans problème au Canada, il est peu probable que cette version végétale de la protéine CP4 EPSPS soit toxique ou allergène

2. Méthode de mise au point

Les lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready® ont été obtenues par transformation de cals de luzerne au moyen d'Agrobacterium (à partir de la lignée R2336 de luzerne) à l'aide d'un vecteur binaire, désigné PV-MSHT4, contenant le gène epsps de la souche bactérienne CP4 (CP4 EPSPS) d'Agrobacterium. La cassette d'expression du gène cp4 epsps renferme la séquence codante cp4 epsps régulée par le promoteur du virus de la mosaïque de la scrofulaire (FMV), un intron d'une protéine de choc thermique (HSP70), une séquence du peptide de transport chloroplastique (CTP2) et une séquence de polyadénylation en 3' de E9. Les cals transformés tolérants le glyphosate ont été sélectionnés en fonction de tolérances élevées au glyphosate par addition de glyphosate aux milieux de culture des végétaux, suivi de la culture des cals dans ces milieux de culture de tissu pour régénérer les plantes.

3. Stabilité de l'intégration au génome de la plante

Les deux lignées renferment une seule copie de la cassette du gène cp4 epsps à un seul locus d'intégration et cette cassette est intacte dans les deux lignées en question. Aucun autre élément du vecteur de transformation PV-MSHT4 n'a été décelé dans ni l'une ni l'autre des lignées de luzerne J101 et J163. Les données provenant des analyses par transfert de Southern appuient la conclusion que seule la protéine CP4 EPSPS prévue devrait être encodée dans sa totalité par les séquences introduites dans les lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready®.

L'analyse de la stabilité des lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready a montré que chaque lignée est stable dans les premières générations transformées ainsi que dans les croisement extérieurs subséquents et la combinaison, par des méthodes traditionnelles ou classiques, des lignées J101 et J 163.

IV. Critères d'évaluation du risque environnemental

1. Possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaise herbe pour l'agriculture ou envahisse les milieux naturels

Selon le document de biologie BIO2005-02, " La biologie de Medicago sativa L. (luzerne) ", les sujets non modifiés de cette espèce n'envahissent pas les milieux sauvages au Canada. Rien au Canada n'indique que M. sativa pourrait présenter les caractéristiques d'une mauvaise herbe ou d'un organisme nuisible. Selon les renseignements fournis par Monsanto Canada, Inc., les lignées J101 et J163 ne diffèrent pas à cet égard de leurs contreparties non modifiées.

L'ACIA a évalué les renseignements fournis par Monsanto Canada Inc. en ce qui concerne le potentiel reproductif et la capacité de survie des lignées J101 et J163 de luzerne et a établi que l'établissement des peuplements, l'amélioration de la croissance, la vigueur ou la longévité des peuplements; les changements dans la sensibilité aux organismes nuisibles et aux maladies associées à la luzerne; l'augmentation des rendements en fourrage et en graines et l'augmentation de la dormance des graines se comparent à la gamme de caractères s'exprimant actuellement chez les variétés de luzerne commerciales.

Aucun avantage compétitif n'a été conféré à ce VCN, outre ceux conférés par la résistance au glyphosate. La tolérance aux herbicides agricoles de type Roundup® ne peut pas faire en sorte que la luzerne se comporte comme une mauvaise herbe ou devienne envahissante dans les milieux naturels, car aucun caractère ayant trait à la reproduction ou à la croissance n'a été modifié.

À la lumière de ces considérations et du fait que le caractère nouveau n'a aucun effet non visé sur le la possibilité que les lignées J101 et J163 pas pour objet de rendre la luzerne nuisible ou envahissante, l'ACIA conclut que le risque que les lignées J101 et J163 de luzerne se comportent en mauvaise herbe ou deviennent envahissantes n'est pas plus grand que chez les variétés de luzerne actuellement commercialisées.

Le plan de gestion agronomique soumis par la société Monsanto Canada comprend un plan de gestion de la tolérance à l'herbicide Roundup® et a été évalué par l'ACIA comme étant satisfaisant. Le plan de gestion de la tolérance à l'herbicide Roundup® fourni des recommandations au sujet des pratiques agricoles de la luzerne Roundup Ready® ainsi qu'un mécanisme efficace qui permet aux producteurs de signaler à la société Monsanto Canada, s'il y a lieu, de problèmes agronomiques survenus lors de la culture de ce produit végétal. Ce mécanisme facilitera la surveillance continue de ce produit par la société Monsanto Canada.

À plus long terme, l'adoption généralisée de plusieurs cultures différentes et de systèmes spécifiques de lutte contre les mauvaises herbes (c.-à-d., de nombreuses combinaisons de cultures et de tolérance à différents herbicides) pourrait provoquer l'apparition de sujets spontanés présentant une gamme de résistances nouvelles à divers herbicides. Dans ces conditions, il ne serait plus possible d'utiliser ces herbicides et tous les avantages qui leur sont liés seraient perdus. Le personnel de vulgarisation agricole des secteurs public et privé doit donc encourager le producteur qui utilise l'une ou l'autre de ces cultures tolérantes à un herbicide à choisir soigneusement ses méthodes de lutte, afin de réduire au minimum l'apparition de populations de mauvaises herbes tolérantes aux herbicides.

2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement

Selon le document BIO2005-02, la seule espèce sauvage apparentée à la luzerne qui est présente au Canada est le M. lupulina. Il a été signalé qu'un croisement entre le M. sativa et le M. lupulina est très peu probable, même considéré comme étant impossible, de se produire dans la nature.

En conséquence, l'ACIA conclut qu'un flux génétique des lignées J101 et J163 de luzerne vers des espèces sauvages apparentées à la luzerne est fort peu probable de se produire au Canada.

3. Possibilité que le VCN devienne nuisible

Les effets recherchés au moyen du caractère nouveau n'ont aucun lien avec le fait que le VCN puisse devenir une mauvaise herbe, sans compter que la luzerne n'est pas considérée comme une espèce nuisible au Canada (Bio2005-02). De plus, les caractéristiques agronomiques observées chez les populations modifiées se situent à l'intérieur de la gamme des valeurs affichées par les variétés de luzerne déjà commercialisées. Les caractéristiques de croissance de la luzerne n'ont donc pas été modifiées par inadvertance. Malgré leur tolérance au glyphosate, les sujets spontanés de luzerne des lignées J101 et J163, provenant de campagnes agricoles antérieures ou provenant de pollinisation croisée (c.-à-d., pollinisation par vent ou par abeille), seront tolérants au glyphosate, mais le producteur pourra les détruire au moyen d'herbicides ayant des modes d'action différents, ou au moyen de pratiques culturales ne faisant pas appel à des herbicides. Les observations au champ n'ont permis de relever aucune modification de la sensibilité de la luzerne aux maladies ou aux organismes nuisibles.

L'ACIA estime par conséquent que les lignées J101 et J163 de luzerne ne présentent aucun risque accru de devenir des végétaux nuisibles.

4. Impact possible sur les organismes non visés

La caractérisation détaillée du gène nouveau et de l'enzyme codée par ce gène, résumée dans la partie III du présent document, permet de conclure que l'expression de la protéine nouvelle ne modifie en rien les propriétés toxiques ou allergènes de la plante. La protéine EPSPS ne présente aucune toxicité connue et est présente dans une vaste gamme de végétaux et microorganismes dont l'utilisation s'avère depuis longtemps sans danger. De plus, une étude aiguë par gavage chez des souris a montré que la protéine EPSPS n'affiche aucune toxicité orale aiguë.

À partir des renseignements qui précèdent, l'ACIA a établi que la dissémination en milieu ouvert des lignées J101 et J163 de luzerne ne modifiera pas de façon appréciable l'impact du végétal sur les autres organismes (y compris l'être humain), par rapport aux variétés actuelles de luzerne.

5. Impact possible sur la biodiversité

Les lignées J101 et J163 ne possèdent aucun caractère phénotypique nouveau qui puisse en étendre l'utilisation au-delà des zones actuelles de production de luzerne au Canada. Comme, au Canada, la luzerne ne s'hybride avec aucune espèce sauvage apparentée, sauf avec les populations sauvages de luzerne, aucun caractère nouveau ne sera transféré dans les milieux sauvages. En outre, on a déterminé que le caractère nouveau présente un risque minime pour les organismes non visés.

L'ACIA en conclut que l'impact possible de la luzerne sur la biodiversité n'a pas été modifié dans le cas des lignées J101 et J163.

V. Critères d'évaluation comme aliments pour bétail

1. Impact(s) possible sur la nutrition du bétail

La luzerne utilisée pour l'analyse de la composition a été obtenue de 5 champs répétés aux États-Unis à partir de fourrage de seconde coupe. Quatre variétés commerciales ont également été cultivées à chaque endroit (12 variétés commerciales en tout). Des échantillons de fourrage prélevés de toutes les parcelles ont été soumis à une analyse des composantes nutritionnelles.

L'analyse de la composition des échantillons de fourrage comprenait les protéines, les matières grasses, les cendres, la teneur en eau, les fibres au détergent acide, les fibres au détergent neutre, la lignine, les acides aminés, le Ca, le Cu, le Fe, le Mg, le Mn, le P, le N, le K, le Na, le Zn et les glucides. Les lignées J101, J163 et J101 x J163 ont été comparées à un témoin non transgénique et à 12 variétés commerciales. Des différences statistiques ont été observées en ce qui concerne certains acides aminés, les fibres au détergent neutre et le sodium, mais on a estimé que les variations observées provenaient de la variabilité normale plutôt que des caractères nouveaux introduits.

L'ACIA a déterminé que les lignées J101, J163 et J101 x J163 de luzerne Roundup Ready® sont équivalentes sur le plan nutritionnel à la variété non transgénique et aux variétés commerciales cultivées aux États-Unis.

2. Impact potentiel sur les animaux et impact lié à une exposition professionnelle ou fortuite chez les humains

L'EPSPS est une enzyme présente dans de nombreux aliments qui sont utilisés sans risque depuis fort longtemps au Canada. Par conséquent, on ne s'attendrait pas à ce qu'elle soit toxique ni allergène. L'enzyme EPSPS CP4 est issue de la souche CP4 d'Agrobacterium, une bactérie terricole qui n'est pas un agent pathogène connu des humains ni des animaux. La séquence d'acides aminés de la protéine EPSPS CP4 que l'on trouve dans les lignées J101 et J163 est identique à celle de la protéine EPSPS CP4 des cultures Roundup Ready® déjà approuvées au Canada. L'EPSPS CP4 n'a aucune homologie d'importance biologique avec des toxines ou allergènes connus. Elle est présente en petites quantités dans l'aliment du bétail. Elle est thermolabile et se dégrade rapidement dans le tractus gastrointestinal. De plus, une étude sur la toxicité orale aigüe sur des souris montre que le niveau sans effet observé (CSEO) est de 475 mg/kg d'EPSPS CP4. À la lumière des renseignements fournis par Monsanto Canada, on peut conclure qu'il est très peu probable que l'EPSPS CP4 soit une nouvelle toxine ou un nouvel allergène.

Selon les niveaux d'exposition prévus et les résultats des épreuves susmentionnées, l'exposition à la protéine EPSPS CP4 ne devrait pas présenter de risque significatif pour le bétail ou les travailleurs/spectateurs.

VI. Nouveaux renseignements requis

Si jamais la société Monsanto Canada Inc. prenait connaissance d'un risque pour l'environnement, y compris un risque pour la santé des humains et des animaux pouvant résulter de la dissémination de ces végétaux, leurs descendants ainsi que tout produit dérivé de ces végétaux au Canada ou ailleurs, elle devrait immédiatement transmettre ces renseignements à l'ACIA. À la lumière de ces renseignements nouveaux, l'ACIA réévaluera l'impact potentiel de l'utilisation proposée comme aliment du bétail et de la dissémination dans l'environnement de ces lignées et réexaminera les décisions qu'elle avait prises à cet égard.

VII. Décision réglementaire

Après examen des données et des renseignements présentés par Monsanto Canada Inc. et après comparaison des lignées J101 et J163 de luzerne Roundup Ready® avec des contreparties non modifiées de luzerne, le Bureau de la biosécurité végétale de la Division de la santé et de la production des végétaux de l'ACIA conclut que le gène nouveau et le caractère correspondant ne confèrent au VCN aucun avantage écologique, intentionnel ou non, si ce végétal était disséminé en milieu ouvert.

Après examen des données et des renseignements présentés, la Section des aliments du bétail de la Division de la santé des animaux et de l'élevage de l'ACIA conclut que le caractère nouveau ne soulève en soi aucune crainte quant à l'innocuité ou à la composition nutritionnelle des lignées J101 et J163. Le fourrage de luzerne et ses sous produits figurent actuellement à l'Annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail. Leur utilisation est donc approuvée pour l'alimentation du bétail au Canada. Les lignées J101 et J163 se sont avérées, après évaluation, essentiellement équivalentes aux variétés classiques de luzerne. Les lignées J101 et J163 et leurs sous-produits sont considérés comme conformes aux définitions actuelles d'ingrédients, et leur utilisation en cette qualité dans les aliments du bétail est approuvée au Canada.

La dissémination en milieu ouvert des lignées J101 et J163 de luzerne, y compris leur utilisation comme aliment du bétail, est par conséquent autorisée à compter du 28 juillet 2005. Toute autre lignée et tout hybride intraspécifique de luzerne qui seraient issus de la même transformation, ainsi que tous leurs descendants, peuvent également être disséminés dans l'environnement et utilisés comme aliments du bétail, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie ait démontré que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau et que les lignées qui en résultent sont essentiellement équivalentes aux variétés de luzerne déjà cultivées, quant à leur impact potentiel sur l'environnement et à leur innocuité comme aliments du bétail.

Les lignées J101 et J163 de luzerne sont soumises aux mêmes exigences phytosanitaires que leurs contreparties non modifiées.

On peut consulter les Décisions relatives aux aliments nouveaux de Santé Canada pour une description de l'évaluation de l'innocuité alimentaire des lignées J101 et J163 de luzerne. Les Décisions relatives aux aliments nouveaux sont accessibles sur le site Web de Santé Canada :
http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/gmf-agm/index_f.html

Document publié par la Division de la production et de la protection des végétaux. Pour de plus amples renseignements, communiquer avec le Bureau de la biosécurité végétale ou avec la Section des aliments du bétail, aux adresses suivantes: